Lấy ý tưởng từ series game giải đố Professor Layton trên hệ máy NDS, "Giáo sư Layton và nàng ca nữ vĩnh hằng" diễn ra ngay sau những sự kiện trong phiên bản "Giáo sư Layton và chiếc sáo ma thần". Mở đầu, Layton nhận được một lá thư từ học trò cũ, nay là nữ ca sĩ opera Jenice Caitly. Lá thư mời Layton đến dự buổi biểu diễn của c&o ...
